转eGFP基因小鼠环境释放安全性评价研究

【摘要】转基因动物产品在逐渐进入人们的生活,人们对转基因动物的安全性也日益关注。目前转基因动物安全性评价策略与方法主要从三个方面入手：转基因动物自身的安全性评价、转基因动物产品安全性评价和转基因动物对环境的安全性评价,转基因动物对环境方面的安全评价近乎空白。本文以转eGFP基因(enhancedgreenfluorescentprotein,增强型绿色荧光蛋白)小鼠为研究对象,主要进行了：(1)用单线法对其进行传代,获得转eGFP基因小鼠及其后代共94只,其中F0代6只,F1代8只,F2代19只,F3代22只,F4代39只,用PCR法和荧光蛋白观察法分别对这些小鼠进行检测,分析转基因动物在传代过程中外源基因的表达情况;(2)用半荧光定量PCR技术(real-timequantitativePCR)对小鼠外源基因在传代过程中的表达情况进行定量检测：(3)分别检测全同胞转基因阴性(对照组)和阳性小鼠个体4周龄和8周龄的肠道微生物的菌群结构,利用PCR法检测转基因小鼠的eGFP基因和WRPE原件,分析转基因小鼠肠道微生物是否发生基因漂移现象,用选择性培养基对肠道微生物中11种菌群(包括总需氧细菌、沙门氏菌、大肠杆菌、葡萄球菌、肠球菌、总厌氧细菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、梭菌、类杆菌、链球菌)进行分离培养,活菌计数,分析转基因小鼠菌群结构是否发生变化；(4)最后,利用DGGE技术研究转eGFP小鼠粪便微生物群落结构,对4周龄和8周龄小鼠肠道微生物V3区的30条和29条特异性条带进行克隆测序。主要研究结果如下：1.以转eGFP基因小鼠原代为父、母本,用单线法对其进行传代,获得转eGFP基因小鼠及其后代共94只。PCR法检测,阳性小鼠为77只,阳性率为81.91%,FO代至F4代阳性小鼠分别为6只、5只、18只、17只和31只,阳性率分别为100.00%、62.50%、94.74%、77.27%和79.49%；荧光蛋白观察,有绿色荧光的个体为80只,阳性率为85.11%,F0代至F4代阳性小鼠分别为6只、8只、13只、21只和32只,阳性率分别为100.00%、100.00%、68.42%、95.45%和82.05%。卡方检验,X2=2.7163,X2<X2005(4),P>0.05,PCR检测结果与绿色荧光性状观察结果差异不显著(P>0.05),说明在本研究中PCR法检测转基因动物可行；转基因动物采用单线法传代可行。2.利用半荧光定量PCR检测F0代转基因小鼠心、肝、脾、肺、肾、盲肠和睾丸中外源基因的表达情况,发现eGFP在所有检测组织中均表达,其中在心、肝、肾和睾丸中表达量相对较高,之间差异不显著(P>0.05)；心脏中表达量最高,极显著高于脾脏、肺脏和盲肠(P<0.01)；在脾脏和盲肠中表达量相对较低。WRPE原件的表达情况与eGFP基因趋势相同。对F0代至F4代小鼠心脏中的外源基因表达情况进行定量检测,发现外源基因在F0代小鼠中的表达量显著高于F1、F2、F3和F4代小鼠(P<0.05),F1至F4代每一代之间均有降低,但差异均不显著(P>0.05),WRPE在不同代(F0、F1、F2、F3和F4代)中的表达情况与eGFP基因趋势相同。表明外源基因在传代过程中的表达量随着传代数的增加,有不断降低的趋势。3.对4周龄和8周龄全同胞阴性(对照组)和转基因阳性小鼠个体粪便微生物菌群活菌计数,发现转基因小鼠个体粪便微生物优势菌群数量与对照组均差异不显著(P>0.05),表明外源基因对转基因动物肠道微生物菌群结构没带来显著性影响。经过PCR检测,没有在4周龄和8周龄小鼠的粪便样品中发现eGFP基因和WRPE原件,说明在研究时限内转基因小鼠肠道没有检测到基因漂移现象。4.利用DGGE技术比较转基因小鼠与对照组小鼠粪便微生物,发现二者的微生物菌群结构相似;对4周龄和8周龄小鼠肠道微生物V3区特异性条带进行测序比对,发现二者具有同样的优势菌群：厚壁菌(Firmicutes)、杆菌(Bacteroidetes)和放线菌(Actinobacteria),均没有发现未知的菌群,说明在研究时限内转基因小鼠与对照组小鼠粪便微生物群落结构相
【作者】余乾；
【导师】赵永聚；
【作者基本信息】西南大学，动物遗传育种与繁殖，2014，硕士
【关键词】转基因小鼠；环境安全；基因漂移；PCR-DGGE；微生物菌群；

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